細(xì)胞培養(yǎng)中的支原體污染的預(yù)防及處理

　　細(xì)胞培養(yǎng)中的支原體污染的預(yù)防及處理
　　支原體是目前已知一類(lèi)能在無(wú)生命培養(yǎng)基上生長(zhǎng)繁殖的小的原核細(xì)胞型微生物。自然界分布廣，種類(lèi)多，有80余種，分為兩個(gè)屬：一為支原體屬(Mycoplasma)，有幾十個(gè)種;另一為脲原體屬(Ureaplasma)，僅有一種。與人類(lèi)感染有關(guān)的主要是肺炎支原體和解脲脲原體。
　　支原體無(wú)細(xì)胞壁(cell wall)，多呈不規(guī)則球狀、長(zhǎng)絲狀，可分枝，營(yíng)寄生共生或腐生。一般侵害對(duì)象為動(dòng)植物，可造成多種疾病。
　　細(xì)胞培養(yǎng)(特別是傳代細(xì)胞)被支原體污染是個(gè)世界性問(wèn)題。國(guó)內(nèi)外研究表明，95%以上是以下四種支原體：口腔支原體(M.orale)、精氨酸支原體(M.arginini)、豬鼻支原體(M.hyorhinis)和菜氏無(wú)膽甾原體(A.laidlawii)，為牛源性。國(guó)外調(diào)查證明，大約有二十多種支原體能污染細(xì)胞，有的細(xì)胞株可以同時(shí)污染兩種以上的支原體。
　　支原體污染的來(lái)源包括工作環(huán)境的污染、操作者本身的污染(某些支原體在人體是正常菌群)、培養(yǎng)基的污染、被污染細(xì)胞造成的交叉污染、實(shí)驗(yàn)器材的污染、制備細(xì)胞的原始組織或器官的污染，等等。
　　體外生長(zhǎng)的細(xì)胞對(duì)微生物及一些有害有毒物質(zhì)沒(méi)有抵抗能力，因此培養(yǎng)基應(yīng)達(dá)到無(wú)化學(xué)物質(zhì)污染、無(wú)微生物污染(如細(xì)菌、真菌、支原體、病毒等)、無(wú)其他對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生損傷作用的生物活性物質(zhì)污染(如抗體、補(bǔ)體)。對(duì)于天然培養(yǎng)基，污染主要來(lái)源于取材過(guò)程及生物材料本身，應(yīng)當(dāng)嚴(yán)格選材，嚴(yán)格操作。對(duì)于合成培養(yǎng)基，污染主要來(lái)源于配制過(guò)程，配制所用的水，器皿應(yīng)十分潔凈，配制后應(yīng)嚴(yán)格過(guò)濾除菌。
　　由于體外培養(yǎng)細(xì)胞自身沒(méi)有抵抗污染的能力，而且培養(yǎng)基中的抗生素(antibiotic)抗污染能力有限，因而培養(yǎng)細(xì)胞一旦發(fā)生污染多數(shù)將無(wú)法挽回。支原體污染后，因?yàn)樗鼈儾粫?huì)使細(xì)胞死亡可以與細(xì)胞長(zhǎng)期共存，培養(yǎng)基一般不發(fā)生渾濁，細(xì)胞無(wú)明顯變化，外觀上給人以正常感覺(jué)，實(shí)則細(xì)胞手到多方面潛在影響，如引起細(xì)胞變形，影響DNA合成，抑制細(xì)胞生長(zhǎng)等。
　　組織細(xì)胞培養(yǎng)工作中，可以從以下幾方面來(lái)預(yù)防支原體的污染：控制環(huán)境污染;嚴(yán)格實(shí)驗(yàn)操作;細(xì)胞培養(yǎng)基和器材要保證無(wú)菌;在細(xì)胞培養(yǎng)基沖加入適量的抗生素(antibiotic)。
　　抗生素(antibiotic)主要用于消毒培養(yǎng)液，是培養(yǎng)過(guò)程中預(yù)防微生物污染的重要手段，也是微生物污染不嚴(yán)重時(shí)的“急救”方法。不同抗生素(antibiotic)殺滅微生物不同，應(yīng)根據(jù)需要選擇。
　　在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中如果發(fā)現(xiàn)破碎的細(xì)胞甚多，培養(yǎng)細(xì)胞需要頻繁改善營(yíng)養(yǎng)環(huán)境才能支持長(zhǎng)期傳代培養(yǎng)時(shí)，應(yīng)該懷疑支原體污染。支原體污染難以觀察特殊的外觀變化，培養(yǎng)液也不渾濁。
　　支原體污染細(xì)胞后，特別是重要的細(xì)胞株，有必要清除支原體，常用方法有：抗生素(antibiotic)處理、抗血清處理、抗生素(antibiotic)加抗血清和補(bǔ)體聯(lián)合處理。要注意的是：支原體沒(méi)有細(xì)胞壁(cell wall)，故作用于細(xì)胞壁(cell wall)生物合成的抗生素(antibiotic)，如內(nèi)酰胺類(lèi)、萬(wàn)古霉素等是不敏感的;對(duì)多粘菌素、利福平、磺胺藥物普遍耐。對(duì)支原體比較有抑制活性抗生素(antibiotic)是四環(huán)素類(lèi)、大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)等，氨基糖苷類(lèi)、氯霉素對(duì)支原體有較小的抑制作用。必要時(shí)更換所有培養(yǎng)用物。通常，濾過(guò)除菌的方法對(duì)支原體是沒(méi)有作用的。
　　由于一些微生物，如支原體，病毒等能通過(guò)濾膜，所以過(guò)濾藥品仍潛在被外源微生物污染的危險(xiǎn)，近年來(lái)，60Co輻射滅菌技術(shù)在醫(yī)藥、食品等領(lǐng)域有較廣的應(yīng)用，由于輻射滅菌能夠*殺滅所有微生物。有試驗(yàn)證實(shí)以2Mrad輻射處理的各培養(yǎng)基樣品達(dá)到了無(wú)菌要求，經(jīng)多批培養(yǎng)試驗(yàn)，輻射滅菌安全可靠;輻射滅菌的培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)性能不低于過(guò)濾組，證明輻射滅菌對(duì)培養(yǎng)基性能無(wú)不良影響;對(duì)血清的輻射滅菌試驗(yàn)效果也表明60COγ射線不影響培養(yǎng)效果。把干粉培養(yǎng)基經(jīng)無(wú)菌操做定量分裝于滅菌容器內(nèi)，輻射后以干粉原型貯藏，不但培養(yǎng)基的純凈性得到保障，而且營(yíng)養(yǎng)性能較過(guò)濾后以水溶液形式保存更穩(wěn)定，對(duì)谷氨酰胺等這類(lèi)水溶液不穩(wěn)定者特別合適。
　　目前，有專門(mén)做支原體檢測(cè)的試劑盒，可以用細(xì)胞滴片檢測(cè)。市場(chǎng)上已有了新一代支原體抗生素(antibiotic)M-Plasmocin(InvivoGen公司)，能有效的殺滅支原體，又不影響細(xì)胞本身的代謝，而且處理過(guò)的細(xì)胞不會(huì)重新感染支原體。另外，配合支原體檢測(cè)試劑盒(市場(chǎng)上有售，如美國(guó)ICN公司的產(chǎn)品)，可以幫助盡快發(fā)現(xiàn)支原體的污染。